近日，上海交通大学微生物代谢国家重点实验室冯雁团队在《Nucleic Acids Research》上发表了题为：“Argonaute integrated single-tube PCR system enables supersensitive detection of rare mutations”的研究论文，揭示了不同高温微生物Argonaute（Ago）蛋白的核酸酶特性及其对单碱基突变（SNV）靶标序列的精准识别规律，发展了“一管式”PCR多重核酸富集和检测的A-Star（Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection）新策略，实现了血液等样本中低丰度突变基因的高效、多重富集和检测。

      通过对人血液或体液中肿瘤细胞释放的DNA片段进行液体活检，可实现肿瘤早期筛查及伴随诊断。然而，游离核酸含量低和易降解的原因，导致检测难度增加。常用的PCR检测方法具有简单、省时等优点，但其检测灵敏度有限（1%以上），因此在复杂背景基因中特异性富集和检测肿瘤基因受到广泛关注。近年来，基因编辑工具酶CRISPR/Cas在核酸检测中的广泛应用，提升了检测灵敏度和便捷性，但Cas酶对靶标序列PAM的依赖性以及长guide RNA合成昂贵且不稳定等问题，导致检测成本、灵敏度、多重性等方面仍存在局限性。因此，研发能特异性富集靶标序列的新型核酸酶是解决上述难题的有效途径。

      该团队在对嗜热微生物Ago蛋白的系统研究中，发现了其具有高温稳定性、可编程性、特异性催化活性、多重正交反应等优良特性；揭示了其对单碱基突变（SNV）靶标序列的精准识别规律；巧妙采用guide DNA“双点错配”设计的策略，使Ago蛋白在PCR变性步骤（94^oC）中选择性剪切野生型基因，而保留的突变基因可在PCR退火（～58^oC）、延伸（～72^oC）步骤中得以循环扩增，并提出了Ago核酸酶-PCR耦联的“A-Star”核酸富集和检测的新策略（图1），从而实现低丰度突变基因的超高效率富集和精准检测。该团队通过对KRAS、PIK3CA和EGFR等多个肿瘤突变基因进行富集，证实了“A-Star”能检测0.01%的低丰度突变，富集效率高达5,500倍。

图1 “A-Star”低丰度SNV富集和检测工作原理

      “A-Star”能在血液和实体瘤组织等复杂样品中稳定检测出靶标肿瘤基因（图2-A）。此外，考虑到实际样本中可能存在多种基因突变，通过设计多对DNA引导链，“A-Star”在单酶“一管式”反应体系中实现了多肿瘤基因的检测，且信号之间无交叉干扰（图2-B）。该团队建立的“A-Star”技术，具有极高灵敏度、简便快捷及多重检测等分子检测优势，在基因诊断及遗传疾病治疗等分子生物学和医学领域具有重要应用潜力。

图2 “A-Star”用于临床样品（A）及多重肿瘤突变（B）的富集和检测