微生物代谢全国重点实验室

近日，微生物代谢全国重点实验室李雷团队在Advanced Science上发表了题为“Multi-Targeting Non-Specific Genome Engineering in Bacteria”的研究论文，首次在细菌中利用多靶点整合酶（Multi-Targeting Integrases，MTIs）开发了一种多靶点非特异基因组工程新方法MNGE，解决了经典的位点特异性整合系统在应用中普适性差的难题，突破了基因或途径进行染色体整合时受宿主限制的瓶颈。该方法无需预先插入整合位点，在多种革兰氏阳性菌（如链霉菌与糖多孢菌）和革兰氏阴性菌（如伯克氏菌与色杆菌）中可一步实现功能基因或大尺度代谢途径（如天然产物合成基因簇）随机、多拷贝基因组整合，为微生物药物、生物基化学品等高效合成提供了全新解决方案。上海交通大学博士生孙润泽和上海师范大学硕士生游蕤翔为论文共同第一作者，李雷长聘教轨副教授与上海师范大学芦银华研究员为共同通讯作者，微生物代谢全国重点实验室为第一通讯单位。

与质粒系统相比，将目标基因或代谢途径整合至宿主染色体上具有更高的遗传稳定性和更低的代谢负担，尤其适合大规模、长周期的工业微生物发酵。然而，现有基因组整合系统存在明显短板：一方面，经典的位点特异性整合系统（如PhiC31）虽能整合大尺度DNA片段，但需在基因组中预先安装特异性整合位点，不仅耗时耗力而且在遗传操作困难的菌株中无法实现；另一方面，转座子系统虽可介导外源基因或途径在染色体中的随机插入，但插入尺度一般较小（<10 kb），很难实现大尺度DNA的基因组整合（如微生物天然产物合成基因簇，尺度通常为~10-150 kb）。

为解决上述瓶颈，研究人员关注到一类特殊的整合酶——多靶点整合酶MTIs。MTIs通常具有较低的序列识别特异性，可靶向基因组中多个非特异位点。他们首先选取了四种MTIs，包括MTI_1737、MTI_2871、MTI_6538和MTI_Cp36，通过密码子优化和启动子调试，首次证明3个MTIs（MTI_1737、MTI_2871与MTI_6538）可在白色链霉菌J1074中实现外源DNA的染色体整合（图1）。尤为值得注意的是，MTI_2871（命名为MTI1）具有更高的整合效率且识别位点极为宽松，仅需核心的TT二核苷酸，理论上可靶向所有细菌基因组乃至所有生命系统的染色体，具有广阔的应用前景（图2）。

图1 基于多靶点整合酶MTIs的MNGE方法设计原理

基于MTI1多靶点整合系统，该团队建立了新一代基因或途径随机多拷贝整合新方法MNGE（图1）。通过系列实验证明了MNGE方法具备以下三大核心优势（图2）：

（1）多靶点随机整合：实现了外源基因（如报告基因idgS-sfp）至少3个拷贝的同时整合且插入位点在染色体中高度随机分布；

（2）大尺度DNA片段整合：实现了41-kb吡啶酰胺类杀真菌剂UK-2合成基因簇与106-kb聚醚类抗生素盐霉素合成基因簇在染色体中的随机整合，并利用染色体位置效应有效提升了UK-2与盐霉素的发酵水平；

（3）宿主普适性广：不仅可用于多种模式链霉菌，也可广泛用于多种工业链霉菌或非链霉菌属放线菌（如多杀菌素产生菌刺糖多孢菌等）。

图2 MNGE 方法在模式菌白色链霉菌J1074中提升UK-2发酵水平及其在多种工业放线菌中的验证

更为重要的是，该团队成功将MNGE方法的应用范围拓展至革兰氏阴性菌（如伯克氏菌与色杆菌）。由于MTI1过表达对革兰氏阴性菌具有更为明显的细胞毒性，首先使用了弱的诱导型启动子（如tipAp和Rhap）替换了强启动子ermEp^*驱动MTI1的表达。借助优化后的MTI1多靶点整合系统，将66-kb的Gq/11强效抑制剂FR900359合成基因簇随机整合至伯克氏菌Burkholderia gladioli ATCC 10248基因组中，成功实现了FR900359的异源合成（图3）。

图示AI 生成的内容可能不正确。

图3 优化MNGE方法在伯克氏菌B. gladioli ATCC 10248中实现FR900359异源合成

综上，这项工作利用MTI1多靶点整合酶独有的特性——兼具位点特异性重组酶的大尺度DNA整合能力与转座子的随机插入能力，在细菌中开发了新一代基因组工程方法MNGE。该方法无需预先安装整合位点，可直接用于多种重要的尤其是遗传难操作的工业微生物的工程改造，为创制高效的微生物细胞工厂提供了强有力的技术支撑。

该项工作得到了山东大学卞小莹教授、王海龙教授，清华大学程功教授与中科院南海海洋研究所马俊英研究员的大力支持。研究获国家重点研发计划（2023YFA0914200）、国家自然科学基金面上项目（32370070和32270095）与上海市合成生物学重大专项资助。

论文链接: https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202521532

招聘信息：上海交通大学生命科学技术学院李雷课题组主要从事微生物天然药物创新发现与高效合成研究，诚招博士后2名，欢迎具有微生物学、合成生物学、天然药物化学等研究背景的学生加入，有意者请将简历发送至lei.li@sjtu.edu.cn。