近日，微生物代谢全国重点实验室童垚俊团队在《Nature Biotechnology》期刊上发表了题为“Programmable, multiplexed and orthogonal gene control in bacteria with attenuated Cas13d systems”的研究论文。同期还以Research Briefing的形式对该工作进行了题为“Revolutionizing biotechnology advances natural products discovery and industrial processing”的报道。该研究创新性地提出“活性-特异性-毒性”平衡策略，首次为原核生物开发了基于单一Cas13d效应子的多功能RNA调控平台——SONAR，使同一个Cas13d框架能够根据crRNA设计分别执行转录本降解、翻译抑制和翻译激活任务。上海交通大学博士研究生童圣坤为论文第一作者，童垚俊为唯一通讯作者，本室为第一通讯单位。

痛点：细胞工厂的“调控难题”

微生物细胞工厂的高效运行，依赖于对代谢网络的精密调控，必须在细胞生长与产物合成之间找到完美的平衡点。然而，现有的调控工具却难以兼顾。传统的DNA层级调控工具受限于细菌的操纵子结构，往往牵一发而动全身，难以对单个基因进行灵活、独立的微调。而被寄予厚望的Cas13系统，虽然具备RNA层级的精准识别能力，却因过强的核酸酶活性，极易引发旁侧切割和宿主毒性。这就导致Cas13系统活性强但毒性高、可切割但难精控、能抑制但功能单一。因此，如何突破这些限制，将Cas13从单一的RNA降解工具，转化为真正可编程、多功能的通用调控平台，正是该研究致力攻克的难题。

理性改造：驯服Cas13d

围绕这一核心痛点，团队首先系统解析了Cas13d在原核细胞中的活性、特异性和细胞毒性之间的关系，发现其切割特异性高度依赖于细胞内的有效酶活性水平。当Cas13d表达过强或切割活性过高时，即使是高保真变体也可能出现旁侧RNA扰动和生长抑制。而当活性被适当降低时，Cas13d则可以在保持靶标敲低能力的同时显著降低非靶标效应。基于活性决定特异性，研究团队通过截短RNase活性中心附近的柔性区域，构建了一系列具有不同活性梯度的减活Cas13d变体（atnCas13d）。其中，Δ251-255变体在靶标敲低能力、旁侧切割控制和宿主生长负担之间达到了最佳平衡（图1）。分子动力学模拟表明，这种改造通过改变催化中心构象和全局结构动态来精准调节RNase活性，从而实现连续化、可调式的工程改造，突破了传统仅依赖点突变的改造局限。

图1. 通过截短Cas13d柔性区域实现RNase调控输出的梯度化工程改造。

功能解耦：打造“多功能枢纽”SONAR系统

团队进一步通过巧妙的crRNA设计和蛋白融合，成功创制了SONAR（Synthetic Orthogonal Nucleic acid Activation and Repression）系统。该系统突破了传统限制，使用完全匹配的crRNA引导atnCas13d进行酶切，实现操纵子整体调控；在5′端引入7个连续错配的PM7crRNA关闭atnCas13d切割活性，但保留其靶向结合目标mRNA的能力以实现单基因翻译抑制；将翻译起始因子IF3融合至atnCas13d，构建出atnCas13d-IF3，在PM7crRNA引导下定位至目标mRNA的5′UTR，即可在保留原有功能的基础上实现翻译激活。这一设计让SONAR真正拥有了转录本降解、翻译抑制和翻译激活三种不同调控模式。

随后，团队利用三个荧光报告基因系统进行了验证，atnCas13d-IF3能够在同一个细胞内同时对mCherry、sfGFP和mTagBFP2分别实施翻译抑制、翻译激活和转录本降解。成功验证了SONAR的正交多路调控能力，已超越单一调控工具的范畴，进化为可并行差异化操控多个遗传模块的“RNA调控枢纽”。研究同时明确了SONAR系统的工程边界，在中低表达水平下系统的正交性和多功能调控效果最为稳定，而在高负荷下可能出现资源竞争。这为后续应用于复杂的合成基因回路和微生物细胞工厂设计提供了重要参考。

图2. 基于atnCas13d-IF3的多功能原核RNA调控平台SONAR。

实战应用：赋能番茄红素细胞工厂

SONAR系统不仅停留在报告基因层面，更在向实际应用层面迈进。团队将其应用于大肠杆菌番茄红素生物合成途径的优化，利用其精准的翻译抑制功能，对必需基因ispU和ispB进行非致死性调控，在不影响细胞存活的前提下释放前体（图3）。通过进一步组合抑制竞争支路（ispU）、激活合成模块（crtEBI）及降解多顺反子转录本（ptsHIcrr），实现了代谢网络的协同重布线。在此条件下，优化菌株的番茄红素产量较出发菌株提高2.39倍，展现了SONAR在微生物细胞工厂改造中的实用价值。

图3. SONAR系统用于增强异源番茄红素生物合成。

总结与展望

童垚俊课题组长期围绕微生物合成生物学开展研究，重点开发微生物基因表达调控与基因组编辑技术。本次SONAR系统的成功开发，将Cas13d扩展为了一个可编程、多功能、可正交组合的原核RNA调控平台。与传统DNA层面的CRISPRi/a或基因编辑工具相比，SONAR更适合快速、可逆、细粒度地调节细菌多基因表达网络。未来，SONAR有望成为细菌生物合成和生物制造中的通用RNA调控平台，推动微生物细胞工厂从“静态改造”走向“动态、可编程、智能化调控”。

该研究得到了国家重点研发，国家自然科学基金、上海市科委等多个项目的资助。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03160-x