近日，微生物代谢全国重点实验室刘文、汤志军团队在国际期刊《Nature Communications》发表了题为“A pyridoxal phosphate-dependent enzyme platform for stereoselective synthesis of γ-tertiary-nitro-noncanonical amino acids”的研究论文。该研究通过反应设计、酶筛选与定向进化，发现了一个全新的PLP酶平台，成功实现了γ-叔硝基非天然氨基酸的高效立体选择性地合成。上海交通大学博士后丁文萍和博士后骆声淦为论文共同第一作者，刘文教授、汤志军副教授以及邹一可副教授为论文共同通讯作者，本室为第一通讯单位。
非天然氨基酸（ncAAs）可作为分子探针、活性官能团和催化中心，在新药创制、绿色制造及合成生物学等领域具有重要应用价值。然而，其立体选择性合成仍面临挑战。以含叔碳手性中心的γ-叔硝基-α-氨基酸为例，它是合成手性α,γ-二氨基酸的关键中间体，也是活性多肽天然产物与药物的重要合成砌块。但在氨基酸骨架中构建此类叔碳手性中心极为困难：传统化学合成步骤繁琐、立体选择性差；生物催化虽高效、高选择性，但目前仍缺乏适用于该类化合物的酶学方法。
研究团队基于对PLP酶的理解，设计了二级硝基烷烃与氧乙酰丝氨酸缩合构建γ-叔硝基非天然氨基酸的非天然反应路线。通过酶学筛选，发现来源于铁螯合素生物合成途径中负责催化吡咯环形成的PLP酶SidM，能够有效催化该反应。优化反应条件后，模型底物转化产率达87%，立体选择性保持99%。
图1. γ-叔硝基-α-氨基酸的生物催化合成机制
SidM展现出优异的底物普适性，间位取代的芳基底物、对位卤素取代底物、延长硝基烷烃侧链以及杂芳基底物都能以高效的产率和立体选择性转化为相应产物。而针对活性不佳的底物，团队基于AlphaFold3预测与分子对接技术，精准锁定活性中心残基并进行定点饱和突变，成功获得单点突变体A99G（SidM-MI）。该突变体催化效率较之前提升6.3倍，显著拓展了底物适用范围，使原本无反应的邻位取代、对甲基及脂肪族硝基烷烃等底物均可被有效转化。
在此基础上，团队通过定向进化实现了立体化学偏好的调控。以SidM-MI为起点，对关键位点进行筛选，获得的三突变体SidM-MIII-S，实现了可选择性制备(2S,4S)构型产物；而获得的SidM-MIII-R则逆转选择性，得到了(2S,4R)产物。值得一提的是，该酶催化平台可放大到克级规模，展现出了良好的应用潜力。
图2. 定向进化技术优化及逆转 SidM 催化 3t 的立体选择性
为阐明催化机制，研究团队结合DFT计算、MD模拟和MMPBSA分析，对SidM及其突变体的生物催化与选择性机制进行了系统解析。结果显示，C−C键形成是该反应的决速步；同时，SidM通过关键残基与底物及PLP辅因子相互作用，稳定过渡态并引导Re面进攻，从而赋予产物R构型选择性，实现了γ-叔硝基非天然氨基酸的立体选择性合成。
刘文、汤志军团队长期从事聚酮、聚肽类天然产物的生物合成研究，系统揭示了多种非天然氨基酸的生物合成过程，发现了氧化、重排、碳碳键断裂与形成等一系列新反应和新酶学机制（Nat. Chem. 2025, 18,152; JACS 2023, 145, 8896; JACS 2022, 144, 4431; JACS 2021, 143, 19719; ACS Catal. 2026, 16, 8609）。本研究将铁螯合素生物合成途径中的SidM重新编程为高效的C-C键形成催化剂，建立了首个通用、可调控、可放大的γ-叔硝基-α-氨基酸生物催化合成平台。该平台不仅实现了在温和水相条件下从简单前体到复杂叔硝基氨基酸的高效转化，还通过定向进化实现了底物范围的拓展与立体选择性的精准调控，为药物化学、肽工程和天然产物合成提供了全新的工具箱。
该研究工作获得了国家自然科学基金委、上海市科委等项目的大力资助。
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