微生物代谢全国重点实验室

近日，微生物代谢全国重点实验室、生命科学技术学院、张江高等研究院瞿旭东团队与厦门大学王斌举团队联合在国际期刊《J. Am. Chem. Soc.》上发表了题为“A Radical Addition–Diradical Coupling Switch Unifies Cytochrome P450-Catalyzed Diketopiperazine Dimerization”的研究论文。该研究阐明了细菌P450酶催化C3–N1′二聚化连接的双自由基偶联机制，并提出以“自由基加成—双自由基偶联”为核心的统一催化框架，为理解二酮哌嗪（DKP）天然产物结构多样性的生物合成规律提供了新的机制认识。上海交通大学研究生杜叶青与厦门大学研究生周太平为论文共同第一作者，瞿旭东教授、魏广证助理研究员和厦门大学王斌举教授为论文共同通讯作者，本室为第一通讯单位。

DKP二聚化：一个长期悬而未决的科学问题

二酮哌嗪（DKP）是由两个氨基酸缩合形成的最小环肽骨架，其结构稳定、易于修饰，广泛存在于天然产物中。P450酶可催化含色氨酸的DKP单体发生位点选择性氧化偶联，由相似的底物生成连接方式各异的二聚体，显著扩展其结构与功能多样性。这些反应可分为DKP二聚化与DKP-核碱基偶联两大类，其中DKP二聚体按偶联位点又可细分为非对称型和对称型。由此引出一个核心科学问题：相似的酶与底物，如何产生如此多样的连接方式？背后是否存在共同的催化规律？

图1. 自然界中已知的具有不同偶联方式的二酮哌嗪（DKP）二聚体

围绕这一科学问题，研究团队长期开展DKP生物合成与酶促结构多样化研究。2018年，发现细菌来源首个催化非对称型C3–C6′和C3–C7′二聚体的P450酶，揭示分子内自由基反应与分子间自由基加成在偶联中的作用（Nat. Commun. 2018）；2020年，进一步鉴定N1–C7′偶联酶，发现不同区域选择性偶联酶具有高度相似的初始双底物结合构型，催化过程中的构象动态决定最终连接方式（Nat. Commun. 2020）；随后开发分枝杆菌全细胞催化体系，通过酶工程实现近百种非对称型DKP二聚体的多样性合成（J. Org. Chem. 2021；Angew. Chem. Int. Ed. 2023）；团队又分别阐明C3–核碱基偶联的自由基加成机制（PNAS. 2024）和C3–C3′对称二聚化中的自由基加成/单电子转移机制（JACS. 2025），逐步建立起对DKP酶促偶联反应的系统认识。

补齐DKP二聚化机制图谱：C3–N1′连接机制

在已建立的机制体系中中，C3–N1′连接是已知细菌DKP二聚化中最后一种缺乏机制解释的偶联模式。团队此前建立的自由基加成模型可以解释C3–C6′/C7′、N1–C7′、C3–核碱基和C3–C3′等连接方式，却难以解释C3–N1′键的形成。由于天然C3–N1′二聚化酶TtpB2难以获得可溶性蛋白，团队以同源酶TtpB1为研究基础，通过结构指导的组合突变获得主要生成C3–N1′产物的TtpB1-M9变体，建立机制研究的替代体系。底物交叉偶联实验和酶–双底物复合物晶体结构表明，不同连接方式的酶仍保持高度保守的双底物结合框架，偶联差异主要来自催化过程中的底物运动与自由基演化。

图2. TtpB2、TtpB1及其突变体催化环二肽cWW二聚化的产物分析

双自由基偶联机制与统一催化框架
进一步结合分子动力学（MD）模拟、伞形采样和QM/MM计算，揭示了C3–N1′键形成的双自由基偶联路径：P450从第一个底物的DKP氮原子夺取氢，形成N10位自由基；第二个底物构象调整靠近催化中心，经氢原子抽提生成N1′位自由基；随后第一个底物发生分子内环化产生C3位自由基，其与N1′位自由基直接偶联，构建C3–N1′键。这一结果揭示了由自由基生成、底物构象变化、环化到分子间偶联的精细时空协同过程，并确立了区别于经典自由基加成的另一类P450偶联机制。

基于上述结果，将细菌P450催化的DKP二聚化反应归纳为两类基本路径：其一为“自由基加成”，即一个底物先活化为自由基，随后向另一底物加成；其二为本研究揭示的“双自由基偶联”，即两个底物依次活化形成自由基，再经环化和自由基重组形成新的连接。两类反应共享保守的双底物结合框架，通过自由基生成位点、反应时序及构象动态的差异实现机制切换。酶工程实验进一步验证了该框架的可调控性，L175F单点突变即可将其主要形成N1–C7′产物，并伴随少量C3–C7′产物。同一P450骨架及其变体可实现C3–C3′、C3–N1′、N1–C7′和C3–C7′四类分子间偶联，展现出显著的催化可塑性。

图3. P450催化不同偶联模式DKP二聚化反应机制

总结与展望

从非对称二聚化酶的发现，到核碱基偶联和对称型二聚化机制的揭示，再到本研究补齐C3–N1′连接机制，团队逐步建立了对P450催化DKP结构多样化的系统认识。提出的“自由基加成—双自由基偶联”统一框架，将不同连接方式纳入共同的催化逻辑中，不仅深化了对天然产物结构多样性形成规律的理解，也为利用P450酶开展新型氧化偶联反应设计和天然产物定向合成提供了理论基础。

本研究工作得到了国家自然科学基金、中国博士后科学基金、云南省科技人才与平台计划和国家重点研发计划等支持，并获得国家蛋白质科学研究（上海）设施及上海同步辐射光源相关线站的技术支持。

论文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c16809