近期，微生物代谢全国重点实验室童垚俊团队(Microbial Synthetic Biology Lab，简称MiSynBio Lab)在微生物基因编辑与生物合成领域取得系列进展。团队围绕原创性非CRISPR-Cas基因编辑工具(STAGE)开发、CRISPR-Cas非基因编辑(Beyond Genome Editing)前沿综述以及基于酶空间工程的α-檀香烯高效生物合成酿酒酵母细胞工厂构建等领域，分别在 《Proceedingsof the National Academy of Sciences》、《Trends in Genetics》和 《Bioresource Technology》期刊发表论文，展示了在新型基因编辑体系构建、CRISPR技术应用拓展以及微生物细胞工厂设计构建等方面的系统性创新布局，为工业微生物系统代谢工程与微生物合成生物学提供了全方位技术支撑。
STAGE：面向重要工业微生物放线菌的非CRISPR-Cas紧凑型高效基因编辑系统开发
在 PNAS 发表的研究中[1]，童垚俊团队联合韩国科学技术院(KAIST) Sang Yup Lee 院士团队首次报道了基于TnpB的非CRISPR-Cas放线菌兼容型基因编辑工具——STAGE (Streptomyces-compatible TnpB-assisted Genome Editing)。
放线菌是天然产物的重要“生物工厂”，但其复杂的基因组结构和有限的遗传操作工具长期制约了代谢工程与药物研发。基于CRISPR-Cas9，童垚俊团队自2013年起致力于为链霉菌以及其他工业微生物构建高效基因编辑工具，形成了一套从基因失活、转录抑制(CRISPRi)、单碱基编辑、多基因编辑到先导编辑的完整遗传操作体系[2-6]。前期工作虽大大简化了放线菌遗传操作流程，但仍然存在大体积质粒构建困难、脱靶与细胞毒性大等技术局限[7]。团队从核酸酶进化角度出发，以一种被认为是Cas12a蛋白进化前身的微型核酸酶TnpB为核心，开发了专门面向放线菌的基因编辑系统——STAGE。相比常用的Cas9，TnpB体积仅有其三分之一(约400个氨基酸)，却依然具备精准、高效、可被特定RNA分子引导编辑双链DNA的能力。研究不仅证明了其能在工业重要放线菌中实现高效率、低脱靶的基因敲除和整个基因簇水平的大片段DNA (act基因簇：17.3 kb与red 基因簇：31.7 kb)删除，还将其进一步拓展成可进行单点(STAGE-BEST)和多点(STAGE-McBEST) C到T的高效碱基编辑器。
本研究联合洪亮教授团队，进一步借助其开发的蛋白质工程通用人工智能平台(Venus)对STAGE系统进行虚拟定向进化，使得TnpB的性能得到进一步提升，编辑效率从40%左右提高至近100%，大幅提升了基因编辑精度与适用性(详见推文)。作为CRISPR-Cas工具的强有力补充，STAGE的建立为工业重要放线菌的天然产物挖掘与系统代谢工程提供了全新利器(图1)。
图1 STAGE概述图
上海交通大学博士后罗晶，研究生Natalie Chia、覃宇禧和上海人工智能实验室青年研究员谈攀为该文章共同第一作者。Sang Yup Lee为共同通讯作者，童垚俊为最后通讯作者，文章得到了洪亮教授团队在人工智能方面的支持。
CRISPR-Cas技术的“第二战场”：基因编辑之外的前沿探索
童垚俊团队长期深耕微生物基因编辑技术和工具的开发，受邀为《Trends in Genetics》杂志撰写综述。童垚俊团队联合华东理工大学张立新教授团队及KAIST的Sang Yup Lee 院士团队，详细总结了CRISPR-Cas技术在基因组编辑之外的六大新兴应用，包括分子诊断、非核酸分子传感、转录调控、分子成像、蛋白质互作研究以及单细胞分析(图2)。文章系统梳理了上述跨学科应用的原理、进展与挑战，并探讨了人工智能、微流控等新兴技术与CRISPR的融合潜力，为未来研究提供了前瞻性视角[8]，详见Cell Press推文。
图2 CRISPR技术在基因编辑外的六大新兴领域及其代表性应用示意图
上海交通大学研究生梁宇、童圣坤为文章共同第一作者，张立新和Sang Yup Lee为共同通讯作者，童垚俊为最后通讯作者。
应用出口探索：酶空间工程结合传统代谢工程用于构建高效合成α-檀香烯的酿酒酵母细胞工厂
应用自主开发的合成生物学使能技术，童垚俊团队联合华东理工大学张立新教授团队，针对檀香精油关键核心组分α-檀烯的可持续供应难题，构建并系统优化了酵母细胞工厂，相关工作发表于《Bioresource Technology》期刊[9]。研究首先解析了通路中9个关键酶的亚细胞定位分布，发现部分定位于内质网或细胞核的酶影响了通路效率。团队通过理性设计实现了酶的空间重定位，如对HMG1进行截短以解除内质网锚定，为ERG10添加核输出信号以恢复其在细胞质中的功能；同时，通过下调ERG9表达、在DPP1和LPP1位点实现整合及支路切断，并增强IDI1和ERG20等关键酶的表达水平，进一步优化了代谢流分布。在发酵工艺方面，通过调节渗透压等条件提升了生产性能。最终，在5 L分批补料发酵中，α-檀烯滴度达到568.59 mg/L，较初始菌株提升超过两个数量级(>130倍)。该研究建立了“空间定位优化—代谢通路重构—过程工程调控”协同的细胞工厂构建策略(图3)，为其他真核微生物高效生产高价值化合物提供了可推广的范例(详见推文)
图3 亚细胞定位代谢工程指导的α-檀烯高效生物合成酵母细胞工厂构建示意图
上海交通大学研究生谭文文、童圣坤为文章共同第一作者。张立新为共同通讯作者，童垚俊为最后通讯作者。
上述系列成果得到国家重点研发(2021YFA0909500)、国家自然科学基金(32170080、32370026)、上海市“科技创新行动计划”合成生物学领域项目(24HC2810200)、上海交通大学“基础研发特区计划”(21TQ1400204)以及微生物代谢全国重点实验室开放课题(MMLKF22-03)等多个基金资助。
参考文献：
1. Luo, J., et al, STAGE: A compact and versatile TnpB-based genome editing toolkit for Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 122 (35) e2509146122. 2025.
2. Whitford, C.M., et al, Systems analysis of highly multiplexed CRISPR-base editing in Streptomycetes. ACS Synth. Biol., 12 (8), 2353-2366. 2023.
3. Tong, Y., et al, CRISPR-Cas9-based, CRISPRi, and CRISPR-BEST-mediated genetic manipulation in streptomycetes. Nat. Protoc., 15, 2470-2502. 2020.
4. Tong, Y., et al, Highly efficient DSB-free base editing for streptomycetes with CRISPR-BEST. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 116, 20366-20375. 2019.
5. Tong, Y., et al, A versatile genetic engineering toolkit for E. coli based on CRISPR-prime editing. Nat. Commun., 12, 5206. 2021.
6. Tong, Y., et al, CRISPR-Cas9 based engineering of actinomycetal genomes. ACS Synth. Biol., 4, 1020-1029. 2015.
7. Tong, Y., et al, CRISPR/Cas-based genome engineering in natural product discovery. Nat. Prod. Rep., 36, 1262-1280. 2019.
8. Liang, Y., et al, Expanding horizons of CRISPR applications beyond genome editing. Trends Genet., doi: 10.1016/j.tig.2025.06.003. 2025.
9. Tan, W., et al, Rational spatial rewiring of key enzymes enhances α-santalene production in Saccharomyces cerevisiae. Bioresour. Technol., 436,133027. 2025.
课题组简介
童垚俊，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢全国重点实验室PI (https://life.sjtu.edu.cn/teacher/YaojunTong)。研究兴趣为回答微生物合成生物学相关的基础及应用问题，如使能赋能技术开发、社会微生物学以及微生物细胞工厂构建等。在《Nature Protocols》、《PNAS》、《Nature Communications》、《Science Bulletin》等发表论文40余篇，申请专利10多件。担任国际代谢工程学会(IMES)青年委员会(ECC)委员、中国微生物学会微生物代谢与生物制造专业委员会主任委员、中国微生物学会分子微生物学及生物工程专业委员会委员兼秘书长、中国遗传学会标准化工作委员会委员、《Synthetic and Systems Biotechnology》副主编等。实验室长期招收合成生物学与人工智能相关领域博士后，欢迎感兴趣的同学联系。
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