近日，微生物代谢全国重点实验室邓子新院士团队蒋明课题组在国际权威期刊《Angewandte Chemie International Edition》发表了题为“Discovery of a Heme-Dependent Enzyme Catalyzing Nitrogen–Nitrogen Bond Formation in Kinamycin Biosynthesis”的研究论文。该研究鉴定出一种新型血红素依赖性蛋白Alp1J，系统阐明了其在醌那霉素生物合成中催化氮-氮键形成的关键作用，为基于基因组挖掘与合成生物学策略开发含氮-氮键新型治疗药物奠定了坚实基础。上海交通大学赵宇春博士和肖志宏博士为该论文共同第一作者，蒋明副研究员为通讯作者，本室为第一单位。
含氮-氮键的化合物在化学合成及医药、农业和材料科学领域具有重要应用价值。作为关键官能团，氮-氮键赋予化合物优异的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗疟和抗癌等。该类结构在药物设计中备受关注，FDA每年批准的新药中，含氮-氮键药物的比例呈显著上升趋势。然而，受氮原子自身亲核性影响，氮-氮键的化学合成难度较大，传统方法常面临效率低、环境污染等问题。醌那霉素属于II型聚酮化合物，其分子中的重氮键是其具有优良抗菌和抗肿瘤活性的重要结构基础。2023年，蒋明课题组曾成功解析醌那霉素生物合成中氮-氮键的上载机制（Nature Communications, 2023），但其核心步骤即氮-氮键本身的形成机制仍不明确。
图1 醌那霉素和磷酰肼霉素生物合成中谷氨酰肼的推测生物合成途径
在醌那霉素重氮键的生物合成过程中，谷氨酰肼被确认为两个氮原子的供体，然而其前体hydrazinosuccinic acid（HA）的合成机制尚未阐明。谷氨酰肼同时是磷酰肼霉素和醌那霉素生物合成中氮-氮键的共同前体。在这两种化合物的生物合成基因簇中，有5个同源基因编码的蛋白被推测参与谷氨酰肼合成，其中4个蛋白功能已获验证。由于这两个基因簇中均未发现与已知氮-氮键合成酶同源的编码蛋白，唯一未被表征的FzmP与Alp1J被推测可能负责催化肼中间体HA中氮-氮键的形成。
此外，醌那霉素类天然产物的生物合成基因簇中均保守存在一个铁氧还蛋白Alp1I，其编码基因与alp1J紧密相邻。为确认Alp1J和Alp1I的功能，课题组通过基因敲除回补、化学喂养、体内重构实验和体外生化反应，证实Alp1J负责催化氮-氮键的生成。研究还发现，Alp1J与Alp1I可形成稳定的复合物，在溶液中以二聚体形式存在，该复合结构能有效保护辅因子血红素与铁硫簇，显著提升催化效率与稳定性。
图2 Alp1J的体外功能研究
为深入解析Alp1J的催化机制，课题组利用Chai-1对Alp1J-Alp1I复合物进行结构预测。结果显示该复合物具有独特的“二聚-异源二聚”四级结构：两个Alp1J单体形成对称二聚体，每个Alp1J再与一个Alp1I通过9个盐桥和16个氢键构成稳定异源二聚体。该构型中Alp1I的铁硫簇与Alp1J活性中心的血红素间保持约8 Å的距离，有利于电子传递。关键残基（Arg514、Asn518、Arg568和Arg587）通过氢键与盐桥网络固定底物羧基，点突变实验证实这些位点为催化活性所必需。此外，底物替代实验证实，Alp1J通过四电子还原途径，将亚硝酸盐逐步还原为一氧化氮和羟胺，进而催化羟胺与L-天冬氨酸的氨基反应生成HA。
图3 Alp1J-Alp1I复合物的预测结构
综上，该研究为深入理解这一新型血红素依赖蛋白家族的催化机制奠定了理论基础，并为氮-氮键的构建提供了新的理论认知。同时，该工作为后续通过基因组挖掘与生物催化技术开发更多含氮-氮键的天然产物奠定了坚实基础。
该研究工作得到国家自然科学基金面上项目和国家自然科学基金青年学生基础研究项目的资助。
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