微生物代谢全国重点实验室

近日，本室邓子新团队康前进研究小组在国际权威期刊《Nature Communications》杂志上发表了题为“Insertion sequence transposition inactivates CRISPR-Cas immunity”的研究论文，揭示了IS元件转座高效失活CRISPR-Cas系统的全新机制。上海交通大学博士研究生盛勇和王珩瑜为该论文的共同第一作者。康前进副研究员、白林泉教授与邓子新教授为共同通讯作者。

在长期的生物进化长河中，CRISPR-Cas免疫系统被认为是广泛存在于细菌和古菌中的一种适应性免疫系统，可以有效保护宿主免受噬菌体和其他可移动元件的入侵。然而，从进化的角度来看，CRISPR-Cas免疫系统却是一把“双刃剑”。一方面，它可以抵御外来遗传物质的入侵，但同时也会限制有益外源基因的获取，在一定程度上阻碍了细菌在胁迫环境中的适应性进化。

为研究细菌如何应对CRISPR-Cas免疫系统所带来的不利影响，通过对CRISPRCasdb数据库中所有的CRISPR-Cas系统进行分析，发现了众多天然的CRISPR-Cas屏障被插入序列（insertion sequences, ISs）转座所破坏（图1），推测了这一现象可能与有益外源基因的获取相关。通过一系列分子生物学与遗传学实验等多种技术手段，成功模拟了CRISPR-Cas免疫系统与基因水平转移之间的进化权衡关系。实验结果表明，宿主菌株在经历抗生素胁迫的巨大压力下，IS元件通过转座至cas基因，实现宿主菌与带有protospacer序列的外源抗生素耐药质粒的凤凰涅槃以及宿主菌在抗生素存在的环境中得以永生。

图1. IS元件转座至CRISPR-Cas系统

为研究IS转座特性及其诱因，研究团队利用具有单个效应蛋白的type II(SpCas9) 与type V (FnCpf1) CRISPR-Cas系统，在大肠杆菌中构建了一套能够选择性地捕获和分析转座至cas基因的IS元件捕获系统。通过对SpCas9-HF1蛋白的RuvC与HNH结构域分别进行了单突变与组合突变，获得了三种具有不同切割能力的蛋白突变体，包括对靶标链进行单链切割的SpCas9-HF1 (D10A)、对非靶标链进行单链切割的SpCas9-HF1 (H840A)以及仅结合，不切割的SpCas9-HF1 (D10A & H840A)，并发现只有当SpCas9-HF1蛋白对染色体进行双链DNA断裂时，才会诱发IS元件转座至cas基因（图2）。

图2. 基于CRISPR-Cas建立高效的IS元件捕获系统

基于密码子的简并性，研究团队对Cas核酸酶编码序列进行了三轮的迭代突变，使其DNA序列尽可能地规避IS元件识别的热点motif。然而，令人意想不到的是，即使对核酸酶编码序列进行了重构，仍然以IS1与IS10为主要的转座类型。通过对这两个元件的识别序列进行系统比较分析，发现正是由于这两个元件在靶标序列识别上呈现的巨大宽泛性潜能，才使得它们成为破坏CRISPR-Cas免疫系统的主要“武器”。随后研究团队在IS元件捕获系统中，异源整合了三种修复能力不同的NHEJ（non-homologous end joining）修复系统。发现尽管IS的转座频率有所下降，但转座事件仍然发生。这一结果表明，原核生物可能无法单独依靠NHEJ系统完全修复CRISPR-Cas系统引发的DNA损伤。进一步凸显了IS元件在驱动菌株对环境适应性中的重要地位。

最后，利用生物信息学工具进行分析发现，IS元件广泛存在于细菌与古菌中，且各IS家族的拷贝数存在很大差异。IS元件的广泛分布意味着它们在不同宿主中可能发挥着关键功能，通过参与宿主的适应性进化过程，从而推动宿主基因组多样性和适应性演化。为了更深入地理解IS元件在宿主进化中的作用，研究团队还探究了IS元件与其他原核生物防御系统的相互作用。有趣的是，IS1与IS10转座到除了CRISPR-Cas系统以外的12种不同的防御系统中，例如限制性修饰系统与基于环状寡核苷酸的抗噬菌体信号系统等。这意味着IS元件可能通过干扰宿主的遗传防御系统，从而增加宿主获取外源有益基因的能力，并促进其自身的适应性进化。

该研究揭示了IS元件转座破坏细菌的CRISPR-Cas免疫的全新机制，进一步拓宽了我们对CRISPR-Cas失活机制的认知范围，也为微生物学、生物技术等相关领域的研究和应用提供重要的指导和启示。

图3. anti-CRISPR机制总览

该研究工作得到了国家重点研发计划（2018YFA0901900、2021YFC2100600）、合成生物学海河实验室攻关项目（22HHSWSS00001）和上海交通大学医工交叉联合项目（YG2019QNA53、YG2022QN071）等项目支持。特别感谢上海交通大学生命科学技术学院仪器共享平台和上海交通大学超算中心π 2.0集群平台提供的技术支持。该研究还得到了林双君教授、陶美凤教授、丁伟特别研究员、唐满成特别研究员和上海农业科学院吴莹莹副研究员的大力支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-39964-7

团队介绍：康前进研究小组工作主要聚焦于微生物生物与化学防御的互做关系，发掘微生物新型活性化学防御物质。在认知微生物环境适应性进化的生理代谢基础上，开展新型防御系统的发掘以及探索新型药物发现的新方法和新技术。课题组长期招聘博士后人员，热烈欢迎有志青年的加入。