近日，本室肖晗副研究员与石婷研究员、钟建江教授合作，在催化领域高水平期刊《ACS Catalysis》发表了题为“Rational engineering of a membrane-anchored promiscuous cytochrome P450 for efficient biosynthesis of valuable ganoderic acids”的研究论文，首次揭示膜锚定细胞色素P450高效催化合成灵芝酸的机制。上海交通大学博士生罗裕欢、杜泽乾、硕士生蒋陈健为共同第一作者，肖晗副研究员、石婷研究员、钟建江教授为共同通讯作者。
图1 膜锚定P450关键氨基酸的鉴定及其控制催化活力和底物选择性的机制
II型灵芝酸是药用高等真菌灵芝在菌丝体发育阶段合成的三萜化合物，具有抗癌、抗转移、抗高血压等显著生物活性，其高效生物合成对于揭示中药物质基础、加速新药研发具有重要意义。然而，II型灵芝酸合成受到复杂调控机制以及灵芝尚不成熟的遗传操作，导致高效生物合成仍极具挑战。研究团队在前期工作中鉴定了一个具有底物杂泛性的膜锚定细胞色素P450 CYP512W2，对合成II型灵芝酸关键代谢节点的GA-Y和GA-Jb至关重要（图2）（Nat Commun, 2022, 13:7740）。
图2 CYP512W2在催化I型灵芝酸HLDOA合成II型灵芝酸GA-Y和GA-Jb的反应路线
该研究首先基于密度泛函理论研究了CYP512W2的最适反应顺序，推测其在C7氧化完成后，能够通过两种可能反应途径进一步将C7羟基化的HLDOA转化为GA-Jb。一种是先发生C15-羟基化，由水合质子介导C7-脱水(直接C15-羟基化方式)；另一种是先发生C7-脱水，同样由水合质子介导，发生C15-羟基化(间接C15-羟基化方式)。计算得到前者的能垒为17.9 kcal/mol，后者为13.1 kcal/mol。由此提出CYP512W2的反应顺序应为：催化C7位羟基化后，自发脱水生成GA-Y，进一步催化C15位羟基化生成GA-Jb (图3)。
图3 CYP512W2催化HLDOA在C7、C11和C15的氧化
为进一步了解CYP512W2的底物选择性，研究团队通过分子动力学模拟等实验，成功鉴定了对催化活性至关重要的关键残基(I108, M114, M213, L294和Y482)。对上述残基进行工程改造，使GA-Y和/或GA-Jb的产量成倍提高。对其机制深入研究发现，I108A突变可以增强C7和C15位优势构象的占比，从而提升CYP512W2的催化活性；Y482F突变通过增大底物的入口通道，M213R通过静电作用调控底物位置，实现了对GA-Y和GA-Jb的产量调控。该研究通过对CYP512W2催化机制的分子解析和关键残基的鉴定，为定向高效合成灵芝酸及其合成途径的全面解析奠定基础。
该研究得到科技部重点科发计划(2018YFA0900600、2021YFC2100601)和国家自然科学基金(31971344、32270038)等项目的支持。特别感谢上海交通大学生命科学技术学院仪器共享平台和超算中心π 2.0集群平台提供的技术支持。
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